嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种精准靶向肿瘤的细胞治疗，在多种癌症治疗中均取得显著性的疗效1，为恶性肿瘤患者带来了希望。目前，已有多种构建嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR-T）的递送方法，比如临床上常见的慢病毒递送或逆转录病毒递送等2, 3。然而，由于病毒载体随机嵌入基因组位点，导致CAR的表达量受嵌入位点的影响，无法稳定且均一地表达，极大影响抗肿瘤活性4, 5。此外，病毒载体随机整合基因组存在致癌风险6, 7。近年来，非病毒递送CRISPR/Cas9构建CAR-T细胞受到广泛关注，直接利用电转递送编码CAR的DNA被证明是可行的8-10，它能够同时实现定点整合CAR和调控内源性基因，避免了随机插入和病毒相关风险。另外，非病毒递送构建CAR-T工艺简单，适合于大规模生产，可极大降低了生产成本。但是递送效率低和高细胞毒性限制了其临床应用。
2023年7月27日，武汉大学医学研究院/免疫与代谢前沿科学中心/武汉大学中南医院张楹/殷昊教授课题组合作在Nature Biomedical Engineering上发表了题为Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS-STING pathway的研究论文。研究者们发现cGAS-STING介导的天然免疫通路在电转双链DNA（dsDNA）诱导原代T细胞死亡中起着至关重要的作用，并揭示电转缓冲液的渗透压能够直接调节cGAS-DNA结合亲和力，进而影响cGAS-STING激活。利用等渗电转缓冲液可极大降低该通路的激活和细胞死亡，制备的CAR-T细胞数比商业电转多达20倍；相较于慢病毒构建的CAR-T, 编辑效率和表达量均提高3倍，杀肿瘤活力更高。
研究者们首先探究了不同类型DNA对T细胞内cGAS-STING激活的影响,包括质粒、线性长双链DNA、线性长单链DNA，短双链DNA和短单链DNA。结果显示，只有当电转质粒和线性长双链DNA时，T细胞的活力明显降低，cGAS-STING通路显著激活。当敲除cGAS或STING时，电转dsDNA的细胞活力显著提高，证明电转长双链DNA诱导原代T细胞死亡主要是由cGAS-STING通路激活导致。
由于cGAS-STING通路具有重要的生物学功能，因此研究者们尝试瞬时抑制cGAS-STING通路，以实现降低电转递送DNA产生的细胞毒性。在试验了小分子抑制剂和siRNA之后，发现STING小分子抑制剂H151无法抑制cGAS-STING激活，而使用siRNA敲低STING需要两次电转递送，对T细胞产生极大的刺激，导致大量细胞死亡。通过高通量筛选电转缓冲液和电转参数后，研究者们发现优化电转缓冲液能显著降低cGAS-STING的激活程度，并且能够有效提高T细胞活力和电转递送效率。进一步机制研究发现，电转缓冲液的渗透压能够调控细胞内cGAS与DNA的结合亲和力，进而影响第二信使2’3’-cGAMP的产生，最终调节cGAS-STING通路的激活。当电转缓冲液的渗透压为等渗时，cGAS-DNA的结合亲和力降低，仅产生少量2’3’-cGAMP，极大降低了cGAS-STING激活。最后，研究者们利用等渗电转缓冲液构建CAR-T细胞，该方法产生的CAR-T阳性细胞绝对数比使用商业电转缓冲液多达20倍。与传统的慢病毒递送相比，利用等渗电转缓冲液递送CRISPR构建CAR-T的效率更高，并且具有比慢病毒递送构建的CAR-T细胞更高的抗肿瘤活性。
示意图. 等渗电转缓冲液通过降低cGAS-STING激活，提高了T细胞的活力和CAR靶向插入效率。
综上，研究发现cGAS-STING通路在电转DNA诱导T细胞死亡中起关键作用，并且揭示了电转缓冲液的渗透压通过调控cGAS-DNA的结合能力，进而影响了该通路的激活。基于该机制的发现，本研究开发了一种准确、高效且安全的递送方法用于构建更有效的CAR-T细胞。本研究为调控cGAS-STING通路的激活打开了新思路，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化研究奠定了基础。随着进一步研究和实践，我们相信非病毒递送方法将在CAR-T细胞治疗领域取得更大的突破，为癌症患者带来更多希望和福音。
武汉大学医学研究院研究生安静、云南大学生命科学学院研究生张川平、武汉大学医学研究院研究生邱厚圆和博士后张红霞为共同第一作者。武汉大学医学研究院张楹教授和殷昊教授为共同通讯作者。殷昊教授是泰康生命医学中心双聘PI。武汉大学医学研究院仪器设备共享中心为论文提供了硬件平台，及武汉大学舒红兵实验室提供了STING敲除小鼠。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41551-023-01073-7
参考文献：
1. Watanabe, N., Mo, F. & McKenna, M.K. Impact of manufacturing procedures on CAR T cell functionality. Frontiers in immunology 13 (2022).
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3. Milone, M.C. & O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia 32, 1529-1541 (2018).
4. Eyquem, J. et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature 543, 113-117 (2017).
5. Ellis, J. Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors. Human gene therapy 16, 1241-1246 (2005).
6. Lewinski, M.K. & Bushman, F.D. Retroviral DNA integration—mechanism and consequences. Advances in genetics 55, 147-181 (2005).
7. Howe, S.J. et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. The Journal of clinical investigation 118 (2008).
8. Roth, T.L. et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559, 405-409 (2018).
9. Zhang, J. et al. Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL. Nature 609, 369-374 (2022).
10. Foy, S.P. et al. Non-viral precision T cell receptor replacement for personalized cell therapy. Nature, 1-3 (2022).
